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BD流式細胞儀細胞周期/DNA分析方法

更新時間:2015-12-24瀏覽:3653次
 一、鞘液準備(至少3LPBS,提前一天準備)
 
0.01M的PBS配制方法:800ml蒸餾水中溶解NaCl8.0g;KCl0.2g;Na2HPO40.24g;調節pH到7.2-7.4(用HCl或NaOH調節,各地蒸餾水的酸堿度不同),加蒸餾水定容至1L,0.22um濾膜過濾后,室溫保存。
 
二、制備一個陰性對照來
 
    設定流式細胞儀的取樣參數和十字門的范圍:沒有染色的細胞(制備過程如下1-6)
 
三、若做DNA倍體分析,需另設附加對照
 
    管腫瘤細胞和外周血單核細胞的混合管,比例至少為2:1
 
四、BD流式細胞儀細胞周期/DNA分析實驗步驟
 
1、將細胞消化后,用冷PBS洗細胞兩次,300g×5min(若細胞數過少可提高轉速到500g),為減少細胞損失可用1.5ml離心管離心;
2、棄上清留大約50ul下面的液體防止碰到細胞團,加入1mlBufferSolution并低速混勻細胞。
3、室溫離心,300g×5min;
4、重復2、3一次;
5、棄上清留大約50ul下面的液體,加入1mlBufferSolution重懸細胞;
6、計數細胞,用BufferSolution將細胞密度調為1×106個/ml;
7、染色:
A.取0.5ml含細胞5×105個;
B.每管加入250ulSolutionA,用手輕拍混勻(勿用漩渦混勻);
C.室溫反應10min,保留SolutionA;
D.加入200ulSolutionB,輕輕混勻;
E.室溫反應10min,保留SolutionA+B;
F.加入200ul冷SolutionC,輕輕混勻,黑暗處2-8℃孵育10min;
用50um尼龍網過濾細胞,加入上樣管上流式分析(3h內分析完)。
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